老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置

；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶
，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次

，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min
，按1

：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠表皮角化分离自皮肤组织；表皮位于动物皮肤的外层
，由胚胎时期外胚层形成
，具有抗摩擦和抗损伤的作用。表皮是皮肤的浅层结构
，由复层扁平上皮构成
。从基底层到表面可分为五层，即基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。表皮角化细胞（KC）是构成表皮的主要细胞成分，在体内处于不断增殖过程中，分裂的角化细胞主要位于其基底层
，少数位于棘细胞层。随着向表层的推移
，细胞的分化程度逐渐增加，并丧失分裂活性。

方法简介
：

公司实验室分离的大鼠表皮角化先消化、后-胶原酶混合消化法制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的大鼠表皮角化经PCNA免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1
、HBV、HCV
、支原体、细菌
、酵母和真菌等
。

培养信息
：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气
，95%；CO2
，5%

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液

、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系

。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象
。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠胱抑素S(CST4)检测试剂盒 ，英文名： CST4 ELISA Kit

Rabbit apolipoprotein E (Apo-E) ELISA Kit 兔载脂蛋白E(Apo-E)检测试剂盒

乙型流感病毒(IBV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 48T

CLIAKitforMMP-5(Humanmaixmetalloproteinase5)ELISAKit人基质金属蛋白酶5

体液基质金属蛋白酶(MMP-12)活性比色法定量检测试剂盒20次

ELISAKitVK1犬K1

CNTN5重组小鼠 Contactin 5 / CNTN5 蛋白 Protein

含RNA结合冷休克域蛋白E1(CSDE1)重组蛋白 Recombinant Cold Shock Domain Containing Protein E1, RNA Binding (CSDE1)

PROS1重组人 PROS1 / Protein S 蛋白 Protein

CAMK4 Protein Human 重组人 CAMK4 / CaMKIV 蛋白 (GST 标签)

CD40LG Protein Canine 重组狗 CD40L / CD154 / TNFSF5 蛋白 (Fc 标签)

含RNA结合冷休克域蛋白E1(CSDE1)重组蛋白 Recombinant Cold Shock Domain Containing Protein E1, RNA Binding (CSDE1)

CAMK4 Protein Human 重组人 CAMK4 / CaMKIV 蛋白 (GST 标签)

CNTN5重组小鼠 Contactin 5 / CNTN5 蛋白 Protein

CD40LG Protein Canine 重组狗 CD40L / CD154 / TNFSF5 蛋白 (Fc 标签)

PROS1重组人 PROS1 / Protein S 蛋白 Protein

鸭白介素6(IL-6)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human ai bactericidal permeability increasing protein aibody (BPI-Ab) ELISA Kit 人抗杀菌通透性蛋白抗体(BPI-Ab)检测试剂盒

HumanVasoactiveIestinalPeptide,VIPELISAKit 人血管活性肠肽(VIP)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforACO-2(Humanaconitase2)ELISAKit人乌头酸酶2

烟草叶片原生质细胞分离试剂盒5次

Mouseplasmin-aiplasmincomplex,PAPELISAKit小鼠纤溶酶抗纤溶酶复合物(PAP)检测试剂盒规格：96T/48T

大鼠表皮角化细胞氧化酶（XOD）测试盒（比色法）

植物二(MDA)测定试剂盒(比色法)

（VitaminE）测定试剂盒（比色法）

超微量Na+K+–ATP酶测定试剂盒