老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s


，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min

，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃
，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3
、PBS冲洗细胞2次
，每次10min

，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6
、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

大鼠骨骼肌分离自四肢肌肉组织
；骨骼肌又称横纹肌
，肌肉中的一种，约占全身重量的40%
。骨骼肌纤维为长柱形的多核细胞，肌膜的外面有基膜紧密贴附。属于横纹肌
，横纹肌还包括心肌与内脏横纹肌，其中骨骼肌主要分布于四肢。每块肌肉都是具有一定形态、结构和功能的器官
，有丰富的血管、淋巴分布，在躯体神经支配下收缩或舒张，进行随意运动。肌肉可根据共形状、大小
、位置
、起止点、纤维方向和作用等命名
。依形态命名的如斜方肌
、菱形肌、三角肌、梨状肌等。骨骼肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹
，核很多
，且都位于细胞膜下方
。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维
。每一肌原纤维都有相间排列的明带（Ⅰ带）及暗带（A带）。明带染色较浅，而暗带染色较深
。暗带中间有一条较明亮的线称H线。H线的中部有一M线
。明带中间
，有一条较暗的线称为Z线。两个Z线之间的区段
，叫做一个肌节
。骨骼肌细胞也称横纹肌细胞，细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹
，核很多，且都位于细胞膜下方，细胞多呈梭行，具有一定的方向性。

方法简介：

公司实验室分离的大鼠骨骼肌成纤维采用-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的大鼠骨骼肌成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息
：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右
；3代以内状态佳

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气
，95%；CO2
，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书

，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基
、血清比例
、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品：

致病性大肠杆菌(EPEC)核酸试剂盒(PCR-荧光探针法)   48T

单增李斯特菌(LM)核酸试剂盒(PCR-荧光探针法)   48T

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IL-5 peptide 白细胞介素5抗原 0.5mgIL-5 peptide 白细胞介素5抗原

AIF1 Protein Human 重组人 IBA1 / AIF1 蛋白 (His 标签)

IFNAR1重组食蟹猴 IFNAR1 / IFNAR 蛋白 Protein

DDR1 Protein Mouse 重组小鼠 DDR1 Kinase / MCK10 / CD167 蛋白

CNTF重组人 CNTF 蛋白 (His 标签) Protein

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Rat ai alpha fodrin aibody IgG/IgA (-Fodrin IgG/IgA) ELISA Kit 大鼠抗α-胞衬蛋白抗体IgG/IgA(α-Fodrin IgG/IgA)试剂盒

Humanglycosylatedserumprotein,GSPELISAKit 人糖化蛋白(GSP)试剂盒 进口分装

HumanAlpha-fetoprotein,AFP试剂盒人甲种胎儿球蛋白/甲胎蛋白(AFP)试剂盒

植物半胱(cysteine)含量高效液相色谱法定量试剂盒20次

Monkeyβ2-microglobulin,BMG/β2-MGELISAKit猴β2微球蛋白(BMG/β2-MG)试剂盒