老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养

：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s

，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次

，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃
，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定
：

1

、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠食管上皮分离自食管组织；食管是咽和胃之间的消化管，食管在系统发生上起初很短，随着颈部的伸长和心肺的下降
，而逐渐增长。食管可分为颈段、胸段和腹段
。脊椎动物食管的颈段位于气管背后和脊柱前端
，胸段位于左

、右肺之间的纵膈内
，胸段通过膈孔与腹腔内腹相连，腹段很短与胃相连
。在发育过程中
，食管的上皮细胞增殖，由单层变为复层，食管使管腔变狭窄，甚至一度闭锁，以后管腔又重新出现。哺乳动物的食管结构上由内向外分四层：黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜。其中，黏膜层，包括上皮
、固有层和黏膜肌层
。上皮为较厚的未角化的复层扁平上皮
，耐摩擦，有保护作用。在食管与胃贲门交界处，复层扁平上皮突然变成单层柱状上皮
。食管被一层线性排列的
、无角化
、潮湿的复层扁平上皮细胞覆盖
，其顶端细胞膜和细胞间连接复合体联合在一起产生有效渗透屏障
，防止食管内容物的渗入
。特别的是
，层屏障使表层细胞的基质外侧细胞膜和深层细胞的全部细胞膜不暴露于食管腔内规律的大幅波动的渗透压之下。从组织学上讲
，食管上皮由两层组成
，基底层和分化层；其中，仅基底层的细胞可以增殖，然后向食管腔移行
。移行过程伴随有分化的发生和分化标记的依序表达

。食管上皮细胞的培养是研究食管正常生理机制和食管癌变机制的非常好的体外模型
。

方法简介
：

公司实验室分离的大鼠食管上皮采用-胶原酶联合消化法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的大鼠食管上皮经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌
、酵母和真菌等
。

培养信息：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气，95%；CO2，5%

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品
：

人脂蛋白α(Lp-α)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

人骨胶原交联(Cr)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

人Ⅰ型前胶原C末端肽(CⅠCP)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

人脱氧酚/脱氧啉(DPD)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

豚鼠白三烯B4(LTB4)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human cytochrome C (Cyt-C) ELISA Kit 人(Cyt-C)试剂盒

Humanai-alpha-FodrinIgG/IgA,α-FodrinIgG/IgAELISAKit 人抗α-胞衬蛋白抗体IgG/IgA(α-FodrinIgG/IgA)试剂盒 96T/48T 进口分装

Humancyclooxygenase-2,COX-2试剂盒人环加氧酶2(COX-2)试剂盒规格：96T/48T

组织GSK3β激酶活性定量试剂盒(A/B/C)20次

HumanPolySeriumAigen,PHSAELISAKit人多聚血清蛋白(PHSA)试剂盒规格：96T/48T

HA重组甲型流感 H4N6 (A/mallard/Ohio/657/2002) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

S6PDH(NADP sorbitol-6-phosphate dehydrogenase 0.5mgS6PDH(NADP sorbitol-6-phosphate dehydrogenase) 6-0酸脱氢酶抗原

IL1RL1重组人 IL1RL1 / ST2 蛋白 Protein

IMPA1 Protein Human 重组人 IMP1 / IMPA1 蛋白

IL25 Protein Human 重组人 IL25 蛋白 (Fc 标签)

S6PDH(NADP sorbitol-6-phosphate dehydrogenase 0.5mgS6PDH(NADP sorbitol-6-phosphate dehydrogenase) 6-0酸脱氢酶抗原

IMPA1 Protein Human 重组人 IMP1 / IMPA1 蛋白

HA重组甲型流感 H4N6 (A/mallard/Ohio/657/2002) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

IL25 Protein Human 重组人 IL25 蛋白 (Fc 标签)

IL1RL1重组人 IL1RL1 / ST2 蛋白 Protein

大鼠食管上皮细胞人粘膜相关上皮趋化因子(MEC/CCL28)ELISA 试剂盒

Human tumor necrosis factor beta (TNF- beta) ELISA Kit 人肿瘤坏死因子β(TNF-β)试剂盒

HumanMethylaseELISAKit 人甲基化酶(Methylase)试剂盒 96T/48T 进口分装

HumanImmunoreactivegrowthhormone,irGH试剂盒人免疫反应性生长激素(irGH)试剂盒规格
：96T/48T

组织基质金属蛋白酶(MMP-2)琥珀酰明胶法比色定量试剂盒20次

HumanLeukemiainhibitoryfactor,LIFELISAKit人白血病抑制因子(LIF)试剂盒规格
：96T/48T