老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养

：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1

、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h
；

6
、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

细胞简介：

人肺血管平滑肌分离自肺组织

；肺是机体的呼吸器官，位于胸腔
，左右各一，覆盖于心之上。肺有分叶
，左二右三，共五叶。肺经肺系（指气管、支气管等）与喉、鼻相连，故称喉为肺之门户，鼻为肺之外窍
。肺血管平滑肌细胞原代分离培养3天后
，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一

，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时

，常交织成网状


；密度高时

，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合
，并保持上述形态学特征和生长特点。肺血管平滑肌细胞主要功能
：①细胞表面表达介质（ICAM-1和VCAM-1）参与血管壁炎症反应；②是多数重要动脉疾病的靶细胞

。肺血管平滑肌细胞与主要病生理变化：①平滑肌增生易致肺动脉高压
；②先天性肺动脉狭窄
；③肺动脉栓塞。血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素，新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关。

方法简介
：

公司实验室分离的人肺微血管平滑肌采用混合胶原酶消化法制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的人肺微血管平滑肌经α-SMA免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体

、细菌
、酵母和真菌等
。

培养信息
：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传3-5代左右

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气，95%
；CO2
，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象
。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清

。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞
，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞

。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿

。

公司正在出售的产品
：

大鼠血管内皮细胞蛋白C受体(PROCR)检测试剂盒 
，英文名： PROCR ELISA Kit

Mouse hydroxyproline (Hyp) ELISA Kit 小鼠羟脯(Hyp)检测试剂盒

Mousemaixmetalloproteinase13,MMP-13ELISAkit 小鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforHumanBetaLactoglobulin,Beta-LgELISAKit人β乳球蛋白

细胞D-葡萄糖氧化法定量检测试剂盒20次

ELISAKitFⅧAg大鼠第八因子相关抗原

DDR1重组小鼠 DDR1 Kinase / MCK10 / CD167 蛋白 Protein

C-型凝集素域家族11成员A(CLEC11A)重组蛋白 Recombinant C-Type Lectin Domain Family 11, Member A (CLEC11A)

BPIFA2重组人 BPIFA2 / C20orf70 蛋白 Protein

FABP1 Protein Human 重组人 L-FABP / FABP1 蛋白

FCGR3A Protein Rat 重组大鼠 CD16a / FCGR3A 蛋白

VGF神经生长因子诱导蛋白(VGF)重组蛋白 Recombinant VGF Nerve Growth Factor Inducible (VGF)

FABP1 Protein Human 重组人 L-FABP / FABP1 蛋白

CLEC10A重组小鼠 CLEC10A / MGL1 / CD301 蛋白 (Fc 标签) Protein

IFNG Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 / 恒河猴 IFNG / Interferon Gamma 蛋白

SMPDL3A重组人 SMPDL3A 蛋白 Protein

小鼠核因子κB(NF-κB)检测试剂盒 96T/48T

Human adrenal coex aibody (ACA) ELISA Kit 人肾上腺皮质抗体(ACA)检测试剂盒

humanAi-thyroid-globulinaibody,ATGAELISAKIT 人抗甲状腺球蛋白抗体(ATGA/TGAB)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Humanai-OJ-aibody，OJ/IleRS检测试剂盒人OJ抗体/抗异亮氨酰NA合成酶抗体(OJ/IleRS)检测试剂盒规格：96T/48T

植物B1高效液相色谱法定量检测试剂盒20次

humanubiquitinD,UBDELISAKit人泛素蛋白D(UBD)检测试剂盒规格
：96T/48T

人肺微血管平滑肌细胞小鼠β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠β半乳糖苷酶(βGAL)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠β基己糖苷酶A(β-hexosaminidaseA)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠β2微球蛋白(BMG/β2-MG)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装