老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养
：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清


，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃

，5％CO2 培养箱中培养；

5

、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定

：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5
、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h
；

6
、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

小鼠视网膜Muller分离自视网膜组织；视网膜居于眼球壁的内层
，是一层透明的薄膜。视网膜由色素上皮层和视网膜感觉层组成，两层间在病理情况下可分开，称为视网膜脱离
。色素上皮层与脉络膜紧密相连
，由色素上皮细胞组成，它们具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。组织学上视网膜分为10层
，由外向内分别为：色素上皮层、视锥、视杆细胞层

、外界膜、外颗粒层
、外丛状层、内颗粒层、内丛状层、神经节细胞层、神经纤维层、内界膜
。视网膜内层为衬于血管膜内面的一层薄膜，有感光作用
；后部鼻侧有一视神经乳头
。视网膜上的感觉层是由三个神经元组成。神经元是视细胞层
，专司感光

，它包括锥细胞和杆细胞
。视杆细胞主要在离中心凹较远的视网膜上，而视锥细胞则在中心凹处多
。层叫双节细胞，约有10到数百个视细胞通过双节细胞与一个神经节细胞相联系

，负责联络作用。第三层叫节细胞层，专管传导。视网膜是一层菲薄的但又非常复杂的结构，它贴于眼球的后壁部，传递来自视网膜感受器冲动的神经纤维跨越视网膜表面，经由视神经到达出口。视网膜的分辨力是不均匀的
，在黄斑区
，其分辨能力强。视网膜Muller细胞作为视网膜中的主要胶质细胞，大约占视网膜胶质细胞的90%
，因而在视网膜疾病中起着何种作用也受到越来越多的关注。在超微结构水平上
，Muller细胞的胞质似乎比临近的其他细胞更高的电子密度
，更发达的内质网，细胞核是典型的卵圆形或多角形。但在不同物种中或同一物种中的不同部位，Muller细胞形态也会有所差异的。视网膜Muller细胞是一种特化的神经胶质细胞
，不仅具有维持视网膜的正常结构和功能的作用，并调制视网膜神经元活动
，还能参与多种病理过程
，尤其是眼底增殖性病变，如增生性玻璃体视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变等，体外培养Muller细胞是研究这些增殖性病变途径之一
。

方法简介：

公司实验室分离的小鼠视网膜Muller采用胶原酶消化法和反复消化法制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶

。

质量检测

公司实验室分离的小鼠视网膜Muller经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV

、HCV
、支原体、细菌
、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂
、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 梭形
、多角形

传代特性 可传3代左右

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气，95%

；CO2，5%

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后

，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中

，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片

，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞

，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品
：

小鼠脂联素(mouse Adiponectin)   作用：   ELISA   规格：      进口分装

小鼠抗线粒体抗体(mouse AMA)   作用：   ELISA   规格：      进口分装

小鼠抗核抗体(mouse ANA)   作用：   ELISA   规格：      进口分装

小鼠血管紧张素II(mouse ANG II)   作用：   ELISA   规格：      进口分装

小鼠氧还原蛋白过氧化物酶2(PRDX2)试剂盒 96T/48T

Human soluble fibrin monomer complex (SFMC) ELISA Kit 人可溶性血纤蛋白单体复合物(SFMC)试剂盒

Humanarachidonate5-lipoxygenase,ALOX-5ELISAKit 人花生四烯酸5脂加氧酶(ALOX-5)试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitfor15-LO/LOX(Human15-lipoxygenase)ELISAKit人15脂加氧酶

饮料离子(Na)浓度化学比色法定量试剂盒20次

MouseLDL-ICELISAKit小鼠低密度脂蛋白免疫复合物(LDL-IC)试剂盒规格：96T/48T

IL2重组大鼠 Interleukin-2 / IL-2 蛋白 Protein

HCMV UL49(Human Cytomegalovirus UL49 Gene 0.5mgHCMV UL49(Human Cytomegalovirus UL49 Gene) 人巨细胞病毒UL49抗原

IL17F重组人 IL-17F / Interleukin-17F 蛋白 Protein

CD27 Protein Human 重组人 CD27 / TNFRSF7 蛋白 (Fc 标签)

ENPP7 Protein Mouse 重组小鼠 ENPP7 / NPP-7 蛋白

HCMV UL49(Human Cytomegalovirus UL49 Gene 0.5mgHCMV UL49(Human Cytomegalovirus UL49 Gene) 人巨细胞病毒UL49抗原

CD27 Protein Human 重组人 CD27 / TNFRSF7 蛋白 (Fc 标签)

IL2重组大鼠 Interleukin-2 / IL-2 蛋白 Protein

ENPP7 Protein Mouse 重组小鼠 ENPP7 / NPP-7 蛋白

IL17F重组人 IL-17F / Interleukin-17F 蛋白 Protein

小鼠视网膜Muller细胞大鼠多巴胺D1受体(D1R)试剂盒 ，英文名： D1R ELISA Kit

Porcine heat shock protein 70 (HSP-70) ELISA Kit 猪热休克蛋白70(HSP-70)试剂盒

蟹特定基因序列(Cytb)核酸试剂盒 48T

CLIAKitforLTD4(HumanleukoieneD4)ELISAKit人白三烯D4

体液总巯基含量比色法定量试剂盒20次

ELISAKitGH鸡生长因子